На 11 ноември 1926 г. Route 66 официално свързва Чикаго със Санта Моника. Маршрутът минава през осем щата и е дълъг около 2400 мили, или приблизително 3940 километра. Пътят е известен като „Пътят майка“ — название, популяризирано от Джон Стайнбек в „Гроздовете на гнева“. Route 66 не е изграден изцяло от нулата, а обединява съществуващи местни, щатски и национални пътища, много от които първоначално са в лошо състояние. Целта е практична връзка между индустриалния Чикаго и растящите калифорнийски градове.

До края на 30-те години маршрутът още не е напълно асфалтиран, но бързо се превръща в икономическа артерия за малките населени места. По него се появяват бензиностанции, крайпътни ресторанти, мотели и необичайни атракции. През Голямата депресия Route 66 става път за семейства, напускащи районите на Средния запад, засегнати от суша и прашни бури. По време на Втората световна война маршрутът подпомага придвижването на военни конвои и работна сила, а след войната се свързва с масовия автомобилен туризъм и идеята за пътуване без предварително начертан край.

Образът на Route 66 се утвърждава чрез литература, музика, кино и телевизия. Песента „Get Your Kicks on Route 66“, написана от Боби Труп през 1946 г., е изпълнявана от Нат Кинг Коул, Чък Бери, „Ролинг Стоунс“ и други музиканти. Неоновите табели, ретро мотелите, закусвалните и крайпътните забележителности превръщат маршрута в своеобразен музей на американската автомобилна епоха. Фотографът Дейвид Дж. Шварц, пътувал по Route 66 42 пъти за две десетилетия, го описва с формулата „Пътувания, големи автомобили, неонови знаци“ и казва: „По този път усещаш самата земя, докато пътуваш.“

Междущатската пътна мрежа, започната през 50-те години, постепенно отнема трафика от стария път. Новите магистрали са по-бързи и по-преки, но отклоняват автомобилите от градовете и търговските обекти по Route 66. Част от малките населени места западат, а някои крайпътни бизнеси затварят. През 1984 г. междущатският път замества последния участък от историческия маршрут, а година по-късно Route 66 е официално изваден от федералната пътна система.

Това не слага край на историята му. Оцелелите участъци, мостове, бензиностанции, мотели и ресторанти започват да се съхраняват като част от американското културно наследство. За 100-годишнината Пощенската служба на САЩ издава осем марки — по една за всеки щат по трасето. В Тълса, Оклахома, е предвидено централно честване с парад, улични събития, концерти и специален момент, посветен на рождения ден на маршрута. Route 66 вече не е федерална магистрала, но продължава да съществува като пътуване през различни лица на Америка — от прериите на Илинойс до пустините на Аризона и брега на Тихия океан.