Гийом Депардийо е роден на 7 април 1971 г. в Париж в актьорско семейство. Майка му е Елизабет Депардийо, а сестра му Жюли също избира киното. Още на три години той се появява на екран във „Този прекрасен негодник“ с баща си Жерар.

Символичен момент в кариерата му е филмът „Всички утрини на света“ от 1991 г. Там Гийом играе младия Марен Маре, а Жерар – зрелия му образ. Двамата носят една фамилия, но синът трябва да извоюва собствено артистично име.

Пробивът идва през 1995 г. с ролята на Фред във „Чираците“ на Пиер Салвадори. Героят е несръчен, раним и самоунищожителен. През 1996 г. ролята му носи „Сезар“ за най-добър млад актьор и го утвърждава като самостоятелен талант.

Следват участия в „Пола X“ на Леос Каракс, „За войната“ на Бертран Бонело и „Не докосвайте брадвата“ на Жак Ривет. В последния филм Депардийо играе генерал Арман дьо Монриво – осакатен ветеран от Наполеоновите войни, който се връща към живота, любовта и миналото си. Актьорът казва, че благодарение на Ривет отново е започнал да вярва в киното.

Животът му е белязан от зависимости, конфликти и тежки физически изпитания. След инцидент с мотоциклет той претърпява продължително лечение на крака, а по-късно губи крайника. Този личен опит придава особена достоверност на образа му в „Не докосвайте брадвата“, където героят е принуден да живее с последиците от войната.

На 13 октомври 2008 г. Гийом Депардийо умира на 37 години от пневмония в болница в Гарш. Разболява се, докато снима в Румъния филма „Детството на Икар“, който излиза посмъртно. Оставя дъщеря си Луиз и филмография, по-кратка от очакваното, но достатъчно силна, за да го запази в историята на френското кино.